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1.制備細(xì)胞懸液：對于懸液培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接進(jìn)行下面的步驟2（計數(shù)與計算過程）。如果計數(shù)對象為貼壁生長的細(xì)胞，首先需將培養(yǎng)物按如下步驟制備成細(xì)胞懸液。

①終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物一次。

②給培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3～5min 。期間不斷在鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時，棄消化液。

③加入一定量的培養(yǎng)液（如果這些培養(yǎng)細(xì)胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使細(xì)胞脫壁而制成細(xì)胞懸液。

2.計數(shù)與計算過程

①在細(xì)胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。

②用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。

③置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線的細(xì)胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計數(shù)。

④按下式計數(shù)細(xì)胞懸液的密度：細(xì)胞密度＝（4個大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個/ml 。

二、注意事項(xiàng)：

①務(wù)必使分散成單個細(xì)胞，取樣計數(shù)前，充分混勻細(xì)胞懸液。

②顯微鏡下計數(shù)時，遇到2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說明細(xì)胞分散不充分。

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